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A maioria dos estudos metabólicos em camundongos é realizada à temperatura ambiente, embora, nessas condições, diferentemente dos humanos, os camundongos gastem muita energia para manter a temperatura interna. Neste estudo, descrevemos o peso normal e a obesidade induzida por dieta (OID) em camundongos C57BL/6J alimentados com ração padrão ou com uma dieta rica em gordura (45%), respectivamente. Os camundongos foram mantidos por 33 dias a 22, 25, 27,5 e 30 °C em um sistema de calorimetria indireta. Demonstramos que o gasto energético aumenta linearmente de 30 °C para 22 °C e é cerca de 30% maior a 22 °C em ambos os modelos de camundongos. Em camundongos com peso normal, a ingestão alimentar contrabalançou o gasto energético. Por outro lado, os camundongos com OID não diminuíram a ingestão alimentar quando o gasto energético diminuiu. Assim, ao final do estudo, os camundongos a 30 °C apresentaram maior peso corporal, massa gorda e níveis plasmáticos de glicerol e triglicerídeos do que os camundongos a 22 °C. O desequilíbrio observado nos camundongos com OID pode ser devido ao aumento da alimentação baseada no prazer.
O rato é o modelo animal mais comumente usado para o estudo da fisiologia e fisiopatologia humanas, sendo frequentemente o animal padrão utilizado nos estágios iniciais da descoberta e desenvolvimento de fármacos. No entanto, os ratos diferem dos humanos em diversos aspectos fisiológicos importantes e, embora a escala alométrica possa ser usada até certo ponto para transpor esses dados para humanos, as grandes diferenças entre ratos e humanos residem na termorregulação e na homeostase energética. Isso demonstra uma inconsistência fundamental. A massa corporal média de ratos adultos é pelo menos mil vezes menor que a de humanos (50 g vs. 50 kg), e a relação entre área de superfície e massa difere em cerca de 400 vezes devido à transformação geométrica não linear descrita pela Equação 2 de Mee. Como resultado, os ratos perdem significativamente mais calor em relação ao seu volume, sendo, portanto, mais sensíveis à temperatura, mais propensos à hipotermia e apresentando uma taxa metabólica basal média dez vezes maior que a dos humanos. À temperatura ambiente padrão (~22 °C), os ratos precisam aumentar seu gasto energético total (GE) em cerca de 30% para manter a temperatura corporal central. Em temperaturas mais baixas, o gasto energético (GE) aumenta ainda mais, em cerca de 50% e 100% a 15 e 7 °C, respectivamente, em comparação com o GE a 22 °C. Assim, as condições de alojamento padrão induzem uma resposta de estresse por frio, o que pode comprometer a transferibilidade dos resultados obtidos em camundongos para humanos, visto que os humanos que vivem em sociedades modernas passam a maior parte do tempo em condições termoneutras (porque nossa menor relação superfície/volume nos torna menos sensíveis à temperatura, já que criamos uma zona termoneutra (ZTN) ao nosso redor. O GE acima da taxa metabólica basal) abrange uma faixa de aproximadamente 19 a 30 °C⁶, enquanto os camundongos apresentam uma faixa mais alta e estreita, abrangendo apenas 2–4 °C⁷,⁸. De fato, esse importante aspecto tem recebido considerável atenção nos últimos anos⁴,⁷,⁸,⁹,¹⁰,¹¹,¹² e foi sugerido que algumas “diferenças entre espécies” podem ser atenuadas pelo aumento da temperatura da carapaça⁹. No entanto, não há consenso sobre a faixa de temperatura que constitui a termoneutralidade em camundongos. Assim, permanece controverso se a temperatura crítica inferior na faixa termoneutra em camundongos com joelho único está mais próxima de 25 °C ou de 30 °C4, 7, 8, 10, 12. O gasto energético (GE) e outros parâmetros metabólicos foram avaliados apenas em períodos de horas a dias, portanto, não está claro até que ponto a exposição prolongada a diferentes temperaturas pode afetar parâmetros metabólicos como peso corporal, consumo de energia, utilização de substratos, tolerância à glicose, concentrações plasmáticas de lipídios e glicose e hormônios reguladores do apetite. Além disso, são necessárias mais pesquisas para determinar em que medida a dieta pode influenciar esses parâmetros (camundongos obesos induzidos por dieta rica em gordura podem estar mais orientados para uma dieta hedônica). Para fornecer mais informações sobre esse tópico, examinamos o efeito da temperatura de criação nos parâmetros metabólicos mencionados em camundongos machos adultos com peso normal e camundongos machos obesos induzidos por dieta (DIO) com 45% de gordura. Os camundongos foram mantidos a 22, 25, 27,5 ou 30 °C por pelo menos três semanas. Temperaturas abaixo de 22°C não foram estudadas porque o alojamento padrão de animais raramente fica abaixo da temperatura ambiente. Descobrimos que camundongos com peso normal e camundongos DIO com um único círculo responderam de forma semelhante às mudanças na temperatura do recinto em termos de gasto energético (GE), independentemente da condição do recinto (com ou sem abrigo/material para ninho). No entanto, enquanto os camundongos com peso normal ajustaram sua ingestão alimentar de acordo com o GE, a ingestão alimentar dos camundongos DIO foi amplamente independente do GE, resultando em maior ganho de peso. De acordo com os dados de peso corporal, as concentrações plasmáticas de lipídios e corpos cetônicos mostraram que os camundongos DIO a 30°C apresentaram um balanço energético mais positivo do que os camundongos a 22°C. As razões subjacentes para as diferenças no balanço de ingestão de energia e no GE entre camundongos com peso normal e DIO requerem estudos adicionais, mas podem estar relacionadas a alterações fisiopatológicas em camundongos DIO e ao efeito da dieta baseada no prazer como resultado de uma dieta para obesidade.
O gasto energético (GE) aumentou linearmente de 30°C para 22°C e foi cerca de 30% maior a 22°C em comparação com 30°C (Fig. 1a,b). A taxa de troca respiratória (RER) foi independente da temperatura (Fig. 1c, d). A ingestão alimentar foi consistente com a dinâmica do GE e aumentou com a diminuição da temperatura (também cerca de 30% maior a 22°C em comparação com 30°C (Fig. 1e,f)). A ingestão de água, o volume e o nível de atividade não dependeram da temperatura (Fig. 1g).
Camundongos machos (C57BL/6J, 20 semanas de idade, alojados individualmente, n=7) foram mantidos em gaiolas metabólicas a 22°C por uma semana antes do início do estudo. Dois dias após a coleta dos dados basais, a temperatura foi elevada em incrementos de 2°C às 6h da manhã (início da fase clara). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, e a fase escura (18h–6h) é representada por uma caixa cinza. a Gasto energético (kcal/h), b Gasto energético total em diferentes temperaturas (kcal/24 h), c Taxa de troca respiratória (VCO2/VO2: 0,7–1,0), d RER média nas fases clara e escura (VCO2/VO2) (valor zero definido como 0,7). e ingestão alimentar cumulativa (g), f ingestão alimentar total em 24 h, g ingestão total de água em 24 h (ml), h ingestão total de água em 24 h, i nível de atividade cumulativo (m) e j nível de atividade total (m/24 h). Os camundongos foram mantidos na temperatura indicada por 48 horas. Os dados apresentados para 24, 26, 28 e 30 °C referem-se às últimas 24 horas de cada ciclo. Os camundongos permaneceram alimentados durante todo o estudo. A significância estatística foi testada por meio de ANOVA de uma via com medidas repetidas, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Os asteriscos indicam significância para o valor inicial de 22 °C, e o sombreamento indica significância entre os demais grupos, conforme indicado. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001. *P <0,05, **P <0,01, **P <0,001, ****P <0,0001. *P<0,05, **P<0,01, **P<0,001, ****P<0,0001. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001. *P <0,05, **P <0,01, **P <0,001, ****P <0,0001. *P<0,05, **P<0,01, **P<0,001, ****P<0,0001.Os valores médios foram calculados para todo o período experimental (0-192 horas). n = 7.
Assim como no caso dos camundongos com peso normal, o gasto energético (GE) aumentou linearmente com a diminuição da temperatura e, neste caso, o GE também foi cerca de 30% maior a 22 °C em comparação com 30 °C (Fig. 2a,b). A taxa de troca respiratória (RER) não se alterou em diferentes temperaturas (Fig. 2c, d). Ao contrário dos camundongos com peso normal, a ingestão alimentar não foi consistente com o GE em função da temperatura ambiente. A ingestão alimentar, a ingestão de água e o nível de atividade foram independentes da temperatura (Figs. 2e–j).
Camundongos machos (C57BL/6J, 20 semanas) com obesidade induzida por dieta (DIO) foram alojados individualmente em gaiolas metabólicas a 22 °C por uma semana antes do início do estudo. Os camundongos tiveram acesso ad libitum a uma dieta rica em gordura (HFD) com 45% de gordura. Após dois dias de aclimatação, os dados basais foram coletados. Posteriormente, a temperatura foi elevada em incrementos de 2 °C a cada dois dias, às 6h (início da fase clara). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, e a fase escura (18h–6h) é representada por uma caixa cinza. a Gasto energético (kcal/h), b Gasto energético total em diferentes temperaturas (kcal/24 h), c Taxa de troca respiratória (VCO2/VO2: 0,7–1,0), d RER média nas fases clara e escura (VCO2/VO2) (valor zero definido como 0,7). e ingestão alimentar cumulativa (g), f ingestão alimentar total em 24 h, g ingestão total de água em 24 h (ml), h ingestão total de água em 24 h, i nível de atividade cumulativa (m) e j nível de atividade total (m/24 h). Os camundongos foram mantidos na temperatura indicada por 48 horas. Os dados apresentados para 24, 26, 28 e 30 °C referem-se às últimas 24 horas de cada ciclo. Os camundongos foram mantidos em uma dieta rica em gordura (HFD) com 45% de gordura até o final do estudo. A significância estatística foi testada por meio de ANOVA de uma via com medidas repetidas, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. Os asteriscos indicam significância para o valor inicial de 22 °C, e o sombreamento indica significância entre os demais grupos, conforme indicado. *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *Р<0,05, ***Р<0,001, ****Р<0,0001. *P<0,05, ***P<0,001, ****P<0,0001. *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *Р<0,05, ***Р<0,001, ****Р<0,0001. *P<0,05, ***P<0,001, ****P<0,0001.Os valores médios foram calculados para todo o período experimental (0-192 horas). n = 7.
Em outra série de experimentos, examinamos o efeito da temperatura ambiente nos mesmos parâmetros, mas desta vez entre grupos de camundongos mantidos constantemente a uma determinada temperatura. Os camundongos foram divididos em quatro grupos para minimizar as alterações estatísticas na média e no desvio padrão do peso corporal, da gordura e do peso corporal normal (Fig. 3a–c). Após 7 dias de aclimatação, foram registrados 4,5 dias de gasto energético (GE). O GE é significativamente afetado pela temperatura ambiente tanto durante o dia quanto à noite (Fig. 3d) e aumenta linearmente à medida que a temperatura diminui de 27,5 °C para 22 °C (Fig. 3e). Comparado aos outros grupos, o RER do grupo de 25 °C foi ligeiramente reduzido, e não houve diferenças entre os demais grupos (Fig. 3f,g). A ingestão alimentar, paralela ao padrão de GE, aumentou em aproximadamente 30% a 22 °C em comparação com 30 °C (Fig. 3h,i). O consumo de água e os níveis de atividade não diferiram significativamente entre os grupos (Fig. 3j,k). A exposição a diferentes temperaturas por até 33 dias não levou a diferenças no peso corporal, massa magra e massa gorda entre os grupos (Fig. 3n-s), mas resultou em uma diminuição da massa magra de aproximadamente 15% em comparação com os valores autorrelatados (Fig. 3n-s). 3b, r, c)) e a massa gorda aumentou mais de duas vezes (de ~1 g para 2–3 g, Fig. 3c, t, c). Infelizmente, a câmara de 30 °C apresenta erros de calibração e não pode fornecer dados precisos de gasto energético (GE) e taxa de troca respiratória (RER).
- Peso corporal (a), massa magra (b) e massa gorda (c) após 8 dias (um dia antes da transferência para o sistema SABLE). d Consumo de energia (kcal/h). e Consumo médio de energia (0–108 horas) em várias temperaturas (kcal/24 horas). f Quociente respiratório (QR) (VCO2/VO2). g QR médio (VCO2/VO2). h Ingestão alimentar total (g). i Ingestão alimentar média (g/24 horas). j Consumo total de água (ml). k Consumo médio de água (ml/24 h). l Nível de atividade cumulativo (m). m Nível médio de atividade (m/24 h). n Peso corporal no 18º dia, o Variação do peso corporal (do -8º ao 18º dia), p Massa magra no 18º dia, q Variação da massa magra (do -8º ao 18º dia), r Massa gorda no 18º dia e Variação da massa gorda (do -8º ao 18º dia). A significância estatística das medidas repetidas foi testada por meio da ANOVA de uma via, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, ****P<0,0001.Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, sendo a fase escura (18:00-06:00 h) representada por caixas cinzas. Os pontos nos histogramas representam camundongos individuais. Os valores médios foram calculados para todo o período experimental (0-108 horas). n = 7.
Os camundongos foram pareados por peso corporal, massa magra e massa gorda no início do estudo (Figs. 4a–c) e mantidos a 22, 25, 27,5 e 30 °C, como em estudos com camundongos de peso normal. Ao comparar os grupos de camundongos, a relação entre o gasto energético (GE) e a temperatura mostrou uma relação linear semelhante com a temperatura ao longo do tempo nos mesmos animais. Assim, os camundongos mantidos a 22 °C consumiram cerca de 30% mais energia do que os camundongos mantidos a 30 °C (Fig. 4d, e). Ao estudar os efeitos nos animais, a temperatura nem sempre afetou a taxa metabólica de repouso (TMR) (Fig. 4f, g). A ingestão de alimentos, a ingestão de água e a atividade não foram significativamente afetadas pela temperatura (Figs. 4h–m). Após 33 dias de criação, os camundongos a 30 °C apresentaram peso corporal significativamente maior do que os camundongos a 22 °C (Fig. 4n). Em comparação com seus respectivos valores basais, os camundongos criados a 30 °C apresentaram pesos corporais significativamente maiores do que os camundongos criados a 22 °C (média ± erro padrão da média: Fig. 4o). O ganho de peso relativamente maior foi devido a um aumento na massa gorda (Fig. 4p, q) em vez de um aumento na massa magra (Fig. 4r, s). Consistente com o menor valor de gasto energético (GE) a 30 °C, a expressão de vários genes do tecido adiposo marrom (TAM) que aumentam a função/atividade do TAM foi reduzida a 30 °C em comparação com 22 °C: Adra1a, Adrb3 e Prdm16. Outros genes importantes que também aumentam a função/atividade do TAM não foram afetados: Sema3a (regulação do crescimento de neuritos), Tfam (biogênese mitocondrial), Adrb1, Adra2a, Pck1 (gliconeogênese) e Cpt1a. Surpreendentemente, os níveis de Ucp1 e Vegf-a, associados ao aumento da atividade termogênica, não diminuíram no grupo de 30 °C. Na verdade, os níveis de Ucp1 em três camundongos foram maiores do que no grupo de 22 °C, e os níveis de Vegf-a e Adrb2 estavam significativamente elevados. Em comparação com o grupo de 22 °C, os camundongos mantidos a 25 °C e 27,5 °C não apresentaram alterações (Figura Suplementar 1).
- Peso corporal (a), massa magra (b) e massa gorda (c) após 9 dias (um dia antes da transferência para o sistema SABLE). d Consumo energético (GE, kcal/h). e Consumo energético médio (0–96 horas) em várias temperaturas (kcal/24 horas). f Quociente respiratório (QR, VCO2/VO2). g QR médio (VCO2/VO2). h Ingestão alimentar total (g). i Ingestão alimentar média (g/24 horas). j Consumo total de água (ml). k Consumo médio de água (ml/24 h). l Nível de atividade cumulativo (m). m Nível de atividade médio (m/24 h). n Peso corporal no dia 23 (g), o Variação do peso corporal, p Massa magra, q Variação da massa magra (g) no dia 23 em comparação com o dia 9, Variação da massa gorda (g) no dia 23 em comparação com o dia 8, dia 23 em comparação com o dia 8. A significância estatística das medidas repetidas foi testada por meio da ANOVA de uma via, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *Р<0,05, ***Р<0,001, ****Р<0,0001. *P<0,05, ***P<0,001, ****P<0,0001. *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. *Р<0,05, ***Р<0,001, ****Р<0,0001. *P<0,05, ***P<0,001, ****P<0,0001.Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média, sendo a fase escura (18:00-06:00 h) representada por caixas cinzas. Os pontos nos histogramas representam camundongos individuais. Os valores médios foram calculados para todo o período experimental (0-96 horas). n = 7.
Assim como os humanos, os camundongos frequentemente criam microambientes para reduzir a perda de calor para o ambiente externo. Para quantificar a importância desse ambiente para o gasto energético (GE), avaliamos o GE a 22, 25, 27,5 e 30 °C, com ou sem protetores de couro e material para ninho. A 22 °C, a adição de peles padrão reduziu o GE em cerca de 4%. A adição subsequente de material para ninho reduziu o GE em 3–4% (Fig. 5a,b). Não foram observadas alterações significativas na taxa respiratória (RER), ingestão de alimentos, ingestão de água ou níveis de atividade com a adição de casinhas ou peles + material para ninho (Figura 5i–p). A adição de pele e material para ninho também reduziu significativamente o GE a 25 e 30 °C, mas as respostas foram quantitativamente menores. A 27,5 °C, nenhuma diferença foi observada. Notavelmente, nesses experimentos, o GE diminuiu com o aumento da temperatura, neste caso cerca de 57% menor do que o GE a 30 °C em comparação com 22 °C (Fig. 5c–h). A mesma análise foi realizada apenas para a fase de luz, onde o gasto energético (GE) estava mais próximo da taxa metabólica basal, uma vez que, nesse caso, os ratos repousavam principalmente na pele, resultando em tamanhos de efeito comparáveis em diferentes temperaturas (Figura Suplementar 2a–h).
Dados para camundongos em abrigo e material de ninho (azul escuro), em casa, mas sem material de ninho (azul claro) e em casa e com material de ninho (laranja). Consumo de energia (GE, kcal/h) para as salas a, c, e e g a 22, 25, 27,5 e 30 °C; b, d, f e h representam o GE (kcal/h). Dados para camundongos alojados a 22 °C: i taxa respiratória (RER, VCO2/VO2), j RER médio (VCO2/VO2), k ingestão alimentar cumulativa (g), l ingestão alimentar média (g/24 h), m ingestão total de água (mL), n AUC média da ingestão de água (mL/24 h), o atividade total (m), p nível médio de atividade (m/24 h). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média; a fase escura (18:00-06:00 h) é representada por caixas cinzas. Os pontos nos histogramas representam camundongos individuais. A significância estatística das medidas repetidas foi testada por meio da ANOVA de uma via, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01. *P < 0,05, **P < 0,01. *P<0,05, **P<0,01. *P<0,05, **P<0,01. *P < 0,05, **P < 0,01. *P < 0,05, **P < 0,01. *P<0,05, **P<0,01. *P<0,05, **P<0,01.Os valores médios foram calculados para todo o período experimental (0-72 horas). n = 7.
Em camundongos com peso normal (após 2-3 horas de jejum), a criação em diferentes temperaturas não resultou em diferenças significativas nas concentrações plasmáticas de TG, 3-HB, colesterol, ALT e AST, mas sim de HDL em função da temperatura (Figuras 6a-e). As concentrações plasmáticas em jejum de leptina, insulina, peptídeo C e glucagon também não diferiram entre os grupos (Figuras 6g-j). No dia do teste de tolerância à glicose (após 31 dias em diferentes temperaturas), o nível basal de glicose no sangue (após 5-6 horas de jejum) foi de aproximadamente 6,5 mM, sem diferença entre os grupos. A administração de glicose oral aumentou significativamente as concentrações de glicose no sangue em todos os grupos, mas tanto a concentração máxima quanto a área incremental sob a curva (iAUC) (15–120 min) foram menores no grupo de camundongos mantidos a 30 °C (pontos de tempo individuais: P < 0,05–P < 0,0001, Fig. 6k, l) em comparação com os camundongos mantidos a 22, 25 e 27,5 °C (que não diferiram entre si). A administração de glicose oral aumentou significativamente as concentrações de glicose no sangue em todos os grupos, mas tanto a concentração máxima quanto a área incremental sob a curva (iAUC) (15–120 min) foram menores no grupo de camundongos mantidos a 30 °C (pontos de tempo individuais: P < 0,05–P < 0,0001, Fig. 6k, l) em comparação com os camundongos mantidos a 22, 25 e 27,5 °C (que não diferiram entre si). Пероральное введение глюкозы значительно повышало концентрацию глюкозы в крови во всех группах, no как пиковая концентрация, так и A temperatura de imersão em um grupo pequeno (iAUC) (15–120 minutos) é baixa no grupo mais alto, sob temperatura de 30 °C (aproximadamente 30 °C). временные точки: P < 0,05–P < 0,0001, рис 6k, l) para a temperatura ambiente, содержащимися при 22, 25 e 27,5 ° C (которые не различались между собой). A administração oral de glicose aumentou significativamente as concentrações de glicose no sangue em todos os grupos, mas tanto a concentração máxima quanto a área incremental sob a curva (iAUC) (15–120 min) foram menores no grupo de camundongos a 30 °C (pontos de tempo separados: P < 0,05–P < 0,0001, Fig. 6k, l) em comparação com os camundongos mantidos a 22, 25 e 27,5 °C (que não diferiram entre si).口服葡萄糖的给药显着增加了所有组的血糖浓度，但在30 °C饲养的小鼠组中，峰值浓度和曲线下增加面积(iAUC) (15-120 分钟) 均较低（各个时间点：P < 0,05–P < 0,0001,6k,l）与饲养在22,25 27,5°C 的小鼠（彼此之间没有差异）相比。口服 葡萄糖 的 给 药 显着 了 所有组 的 血糖 浓度 但 在 在 在 30 ° C 饲养 小鼠组 中 ，浓度 和 曲线 下 增加 面积 面积 (IAUC) (15-120 分钟) 均 较 低 各 个 点 点 点 点 点：P < 0,05–P < 0,0001,6k,l）与饲养在22、25和27,5°C 的小鼠（彼此之间没有差异）相比。A administração oral de glicose aumentou significativamente as concentrações de glicose no sangue em todos os grupos, mas tanto a concentração máxima quanto a área sob a curva (AUC) (15–120 min) foram menores no grupo de camundongos alimentados a 30°C (em todos os pontos de tempo).: P < 0,05–P < 0,0001, рис. : P < 0,05–P < 0,0001, Fig.6l, l) em comparação com ratos mantidos a 22, 25 e 27,5°C (sem diferença entre si).
As concentrações plasmáticas de TG, 3-HB, colesterol, HDL, ALT, AST, FFA, glicerol, leptina, insulina, peptídeo C e glucagon são apresentadas em camundongos DIO(al) machos adultos após 33 dias de alimentação na temperatura indicada. Os camundongos não foram alimentados 2 a 3 horas antes da coleta de sangue. A exceção foi o teste oral de tolerância à glicose, realizado dois dias antes do término do estudo em camundongos em jejum de 5 a 6 horas e mantidos na temperatura adequada por 31 dias. Os camundongos receberam uma dose de 2 g/kg de peso corporal. Os dados da área sob a curva (L) são expressos como dados incrementais (iAUC). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Os pontos representam amostras individuais. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001, n = 7. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001, n = 7. *P <0,05, **P <0,01, **P <0,001, ****P <0,0001, n = 7. *P<0,05, **P<0,01, **P<0,001, ****P<0,0001, n=7. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001, n = 7. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001, n = 7. *P <0,05, **P <0,01, **P <0,001, ****P <0,0001, n = 7. *P<0,05, **P<0,01, **P<0,001, ****P<0,0001, n=7.
Em camundongos DIO (também em jejum por 2 a 3 horas), as concentrações plasmáticas de colesterol, HDL, ALT, AST e FFA não diferiram entre os grupos. Tanto os TG quanto o glicerol estavam significativamente elevados no grupo de 30 °C em comparação com o grupo de 22 °C (Figuras 7a–h). Em contraste, o 3-GB estava cerca de 25% menor a 30 °C em comparação com 22 °C (Figura 7b). Assim, embora os camundongos mantidos a 22 °C apresentassem um balanço energético positivo geral, conforme sugerido pelo ganho de peso, as diferenças nas concentrações plasmáticas de TG, glicerol e 3-HB sugerem que os camundongos a 22 °C, no momento da coleta das amostras, apresentavam um balanço energético relativamente mais negativo. Os camundongos criados a 30 °C estavam em um estado energeticamente mais negativo. De forma consistente, as concentrações hepáticas de glicerol e TG extraíveis, mas não de glicogênio e colesterol, foram maiores no grupo de 30 °C (Figura Suplementar 3a-d). Para investigar se as diferenças na lipólise dependentes da temperatura (medidas pelos níveis plasmáticos de TG e glicerol) resultam de alterações internas no tecido adiposo epididimal ou inguinal, extraímos tecido adiposo desses locais ao final do estudo e quantificamos os ácidos graxos livres ex vivo e a liberação de glicerol. Em todos os grupos experimentais, as amostras de tecido adiposo dos depósitos epididimal e inguinal apresentaram um aumento de pelo menos duas vezes na produção de glicerol e ácidos graxos livres em resposta à estimulação com isoproterenol (Figura Suplementar 4a–d). No entanto, não foi observado nenhum efeito da temperatura da concha sobre a lipólise basal ou estimulada por isoproterenol. Em consonância com o maior peso corporal e massa gorda, os níveis plasmáticos de leptina foram significativamente maiores no grupo de 30 °C do que no grupo de 22 °C (Figura 7i). Ao contrário, os níveis plasmáticos de insulina e peptídeo C não diferiram entre os grupos de temperatura (Fig. 7k, k), mas o glucagon plasmático apresentou dependência da temperatura, sendo que, neste caso, a 22 °C no grupo oposto foi quase o dobro em comparação com 30 °C. Grupo C (Fig. 7l). O FGF21 não diferiu entre os diferentes grupos de temperatura (Fig. 7m). No dia do teste oral de tolerância à glicose (TOTG), a glicemia basal foi de aproximadamente 10 mM e não diferiu entre os camundongos mantidos em diferentes temperaturas (Fig. 7n). A administração oral de glicose aumentou os níveis de glicose no sangue, atingindo um pico em todos os grupos em uma concentração de cerca de 18 mM 15 minutos após a administração. Não houve diferenças significativas na área sob a curva (AUC) (15–120 min) e nas concentrações em diferentes momentos após a administração (15, 30, 60, 90 e 120 min) (Figura 7n, o).
As concentrações plasmáticas de TG, 3-HB, colesterol, HDL, ALT, AST, FFA, glicerol, leptina, insulina, peptídeo C, glucagon e FGF21 foram demonstradas em camundongos machos adultos DIO (ao) após 33 dias de alimentação. Os camundongos foram mantidos em jejum por 2 a 3 horas antes da coleta de sangue. O teste oral de tolerância à glicose foi uma exceção, pois foi realizado com uma dose de 2 g/kg de peso corporal dois dias antes do final do estudo, em camundongos que permaneceram em jejum por 5 a 6 horas e foram mantidos na temperatura adequada por 31 dias. Os dados da área sob a curva (o) são apresentados como dados incrementais (iAUC). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Os pontos representam amostras individuais. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001, n = 7. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001, n = 7. *P <0,05, **P <0,01, **P <0,001, ****P <0,0001, n = 7. *P<0,05, **P<0,01, **P<0,001, ****P<0,0001, n=7. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001, n = 7. *P < 0,05, **P < 0,01, **P < 0,001, ****P < 0,0001, n = 7. *P <0,05, **P <0,01, **P <0,001, ****P <0,0001, n = 7. *P<0,05, **P<0,01, **P<0,001, ****P<0,0001, n=7.
A transferibilidade de dados de roedores para humanos é uma questão complexa que desempenha um papel central na interpretação da importância das observações no contexto da pesquisa fisiológica e farmacológica. Por razões econômicas e para facilitar a pesquisa, os camundongos são frequentemente mantidos em temperatura ambiente abaixo de sua zona termoneutra, resultando na ativação de vários sistemas fisiológicos compensatórios que aumentam a taxa metabólica e potencialmente prejudicam a translatabilidade dos resultados. Assim, a exposição de camundongos ao frio pode torná-los resistentes à obesidade induzida pela dieta e pode prevenir a hiperglicemia em ratos tratados com estreptozotocina devido ao aumento do transporte de glicose não dependente de insulina. No entanto, não está claro até que ponto a exposição prolongada a várias temperaturas relevantes (da temperatura ambiente à termoneutralidade) afeta a homeostase energética de camundongos com peso normal (alimentados com ração) e camundongos obesos induzidos por dieta (alimentados com dieta rica em gordura) e os parâmetros metabólicos, bem como a capacidade desses animais de equilibrar o aumento do gasto energético com o aumento da ingestão alimentar. O estudo apresentado neste artigo visa esclarecer esse tópico.
Demonstramos que, em camundongos adultos com peso normal e em camundongos machos com obesidade induzida pela dieta (DIO), o gasto energético (GE) é inversamente proporcional à temperatura ambiente entre 22 e 30 °C. Assim, o GE a 22 °C foi cerca de 30% maior do que a 30 °C em ambos os modelos de camundongos. No entanto, uma diferença importante entre camundongos com peso normal e camundongos com DIO é que, enquanto os camundongos com peso normal igualaram o GE em temperaturas mais baixas ajustando a ingestão alimentar de acordo, a ingestão alimentar dos camundongos com DIO variou em diferentes níveis. As temperaturas do estudo foram semelhantes. Após um mês, os camundongos com DIO mantidos a 30 °C ganharam mais peso corporal e massa gorda do que os camundongos mantidos a 22 °C, enquanto humanos normais mantidos na mesma temperatura e pelo mesmo período de tempo não apresentaram febre. A diferença no peso corporal foi dependente da temperatura. Em comparação com temperaturas próximas à termoneutralidade ou à temperatura ambiente, o crescimento à temperatura ambiente resultou em um ganho de peso relativamente menor em camundongos com DIO ou com peso normal alimentados com dieta rica em gordura, mas não em camundongos com peso normal alimentados com dieta adequada. Apoiado por outros estudos17,18,19,20,21 mas não por todos22,23.
A capacidade de criar um microambiente para reduzir a perda de calor é hipotetizada como um fator que desloca a neutralidade térmica para a esquerda8, 12. Em nosso estudo, tanto a adição de material para ninho quanto o ocultamento reduziram o gasto energético, mas não resultaram em neutralidade térmica até 28 °C. Assim, nossos dados não corroboram a hipótese de que o ponto mais baixo da termoneutralidade em camundongos adultos com um único joelho, com ou sem casas enriquecidas ambientalmente, deva ser de 26-28 °C, como demonstrado8,12, mas apoiam outros estudos que mostram temperaturas de termoneutralidade de 30 °C em camundongos com ponto mais baixo7, 10, 24. Para complicar ainda mais a situação, o ponto de termoneutralidade em camundongos demonstrou não ser estático durante o dia, sendo mais baixo durante a fase de repouso (clara), possivelmente devido à menor produção de calorias como resultado da atividade e da termogênese induzida pela dieta. Assim, na fase clara, o ponto mais baixo da termoneutralidade se situa em torno de 29 °C e, na fase escura, em torno de 33 °C25.
Em última análise, a relação entre a temperatura ambiente e o consumo total de energia é determinada pela dissipação de calor. Nesse contexto, a relação entre a área de superfície e o volume é um importante determinante da sensibilidade térmica, afetando tanto a dissipação de calor (área de superfície) quanto a geração de calor (volume). Além da área de superfície, a transferência de calor também é determinada pelo isolamento (taxa de transferência de calor). Em humanos, a massa gorda pode reduzir a perda de calor criando uma barreira isolante ao redor da camada corporal, e foi sugerido que a massa gorda também é importante para o isolamento térmico em camundongos, reduzindo o ponto de termoneutralidade e a sensibilidade à temperatura abaixo do ponto de termoneutralidade (inclinação da curva). Nosso estudo não foi projetado para avaliar diretamente essa possível relação, pois os dados de composição corporal foram coletados 9 dias antes da coleta dos dados de gasto energético e porque a massa gorda não permaneceu estável ao longo do estudo. No entanto, como camundongos com peso normal e camundongos obesos induzidos por dieta (DIO) apresentam um gasto energético 30% menor a 30 °C do que a 22 °C, apesar de uma diferença de pelo menos 5 vezes na massa gorda, nossos dados não corroboram a hipótese de que a obesidade deva fornecer isolamento básico. fator, pelo menos não na faixa de temperatura investigada. Isso está de acordo com outros estudos mais bem elaborados para explorar esse aspecto4,24. Nesses estudos, o efeito isolante da obesidade foi pequeno, mas constatou-se que a pelagem fornece de 30 a 50% do isolamento térmico total4,24. No entanto, em camundongos mortos, a condutividade térmica aumentou em cerca de 450% imediatamente após a morte, sugerindo que o efeito isolante da pelagem é necessário para o funcionamento de mecanismos fisiológicos, incluindo a vasoconstrição. Além das diferenças na pelagem entre camundongos e humanos, o baixo efeito isolante da obesidade em camundongos também pode ser influenciado pelas seguintes considerações: O fator isolante da massa gorda humana é mediado principalmente pela massa (espessura) de gordura subcutânea26,27. Tipicamente, em roedores, representa menos de 20% da gordura total do animal28. Além disso, a massa gorda total pode nem sequer ser uma medida adequada do isolamento térmico de um indivíduo, uma vez que se argumenta que a melhoria do isolamento térmico é compensada pelo inevitável aumento da área de superfície (e, portanto, pelo aumento da perda de calor) à medida que a massa gorda aumenta.
Em camundongos com peso normal, as concentrações plasmáticas em jejum de TG, 3-HB, colesterol, HDL, ALT e AST não se alteraram em diferentes temperaturas por quase 5 semanas, provavelmente porque os camundongos se encontravam no mesmo estado de balanço energético. O peso e a composição corporal permaneceram os mesmos ao final do estudo. De forma consistente com a similaridade na massa gorda, também não houve diferenças nos níveis plasmáticos de leptina, nem nos níveis de insulina, peptídeo C e glucagon em jejum. Mais sinais foram encontrados em camundongos obesos induzidos por dieta (DIO). Embora os camundongos a 22°C também não apresentassem um balanço energético negativo geral nesse estado (já que ganharam peso), ao final do estudo eles estavam relativamente mais deficientes em energia em comparação com os camundongos criados a 30°C, em condições como alta produção de cetonas pelo organismo (3-GB) e diminuição da concentração de glicerol e TG no plasma. No entanto, as diferenças na lipólise dependentes da temperatura não parecem ser resultado de alterações intrínsecas na gordura epididimal ou inguinal, como mudanças na expressão da lipase responsiva a adipohormônios, visto que os ácidos graxos livres (AGL) e o glicerol liberados da gordura extraída desses depósitos estão entre os grupos de temperatura, que são semelhantes entre si. Embora não tenhamos investigado o tônus simpático neste estudo, outros pesquisadores descobriram que ele (com base na frequência cardíaca e na pressão arterial média) está linearmente relacionado à temperatura ambiente em camundongos e é aproximadamente 20% menor a 30 °C do que a 22 °C. Assim, as diferenças no tônus simpático dependentes da temperatura podem desempenhar um papel na lipólise em nosso estudo, mas como um aumento no tônus simpático estimula, em vez de inibir, a lipólise, outros mecanismos podem contrabalançar essa diminuição em camundongos cultivados. Papel potencial na degradação da gordura corporal. Temperatura ambiente. Além disso, parte do efeito estimulatório do tônus simpático sobre a lipólise é mediado indiretamente por uma forte inibição da secreção de insulina, destacando o efeito da suplementação que interrompe a insulina sobre a lipólise30, mas em nosso estudo, a insulina plasmática em jejum e o tônus simpático do peptídeo C em diferentes temperaturas não foram suficientes para alterar a lipólise. Em vez disso, descobrimos que as diferenças no estado energético foram provavelmente o principal fator contribuinte para essas diferenças em camundongos DIO. As razões subjacentes que levam a uma melhor regulação da ingestão alimentar com EE em camundongos com peso normal requerem estudos adicionais. Em geral, no entanto, a ingestão alimentar é controlada por sinais homeostáticos e hedônicos31,32,33. Embora haja debate sobre qual dos dois sinais é quantitativamente mais importante31,32,33, é bem conhecido que o consumo prolongado de alimentos ricos em gordura leva a um comportamento alimentar mais baseado no prazer, que é, em certa medida, não relacionado à homeostase. – ingestão alimentar regulada34,35,36. Portanto, o aumento do comportamento alimentar hedônico em camundongos DIO tratados com 45% de dieta rica em gordura pode ser uma das razões pelas quais esses camundongos não equilibraram a ingestão alimentar com o gasto energético. Curiosamente, diferenças no apetite e nos hormônios reguladores da glicose sanguínea também foram observadas em camundongos DIO com temperatura controlada, mas não em camundongos com peso normal. Em camundongos DIO, os níveis plasmáticos de leptina aumentaram com a temperatura e os níveis de glucagon diminuíram com a temperatura. A extensão em que a temperatura pode influenciar diretamente essas diferenças merece estudos adicionais, mas, no caso da leptina, o balanço energético negativo relativo e, portanto, a menor massa gorda em camundongos a 22°C certamente desempenharam um papel importante, visto que a massa gorda e a leptina plasmática são altamente correlacionadas37. No entanto, a interpretação do sinal do glucagon é mais complexa. Assim como com a insulina, a secreção de glucagon foi fortemente inibida por um aumento no tônus simpático, mas o maior tônus simpático foi previsto para o grupo de 22°C, que apresentou as maiores concentrações plasmáticas de glucagon. A insulina é outro forte regulador do glucagon plasmático, e a resistência à insulina e o diabetes tipo 2 estão fortemente associados à hiperglucagonemia em jejum e pós-prandial 38,39. No entanto, os camundongos DIO em nosso estudo também eram insensíveis à insulina, portanto, esse também não poderia ser o principal fator no aumento da sinalização do glucagon no grupo de 22 °C. O conteúdo de gordura hepática também está positivamente associado a um aumento na concentração plasmática de glucagon, cujos mecanismos, por sua vez, podem incluir resistência hepática ao glucagon, diminuição da produção de ureia, aumento das concentrações circulantes de aminoácidos e aumento da secreção de glucagon estimulada por aminoácidos 40,41,42. No entanto, como as concentrações extraíveis de glicerol e TG não diferiram entre os grupos de temperatura em nosso estudo, esse também não poderia ser um fator potencial no aumento das concentrações plasmáticas no grupo de 22 °C. A triiodotironina (T3) desempenha um papel crítico na taxa metabólica geral e na iniciação da defesa metabólica contra a hipotermia 43,44. Assim, a concentração plasmática de T3, possivelmente controlada por mecanismos mediados centralmente,45,46 aumenta tanto em camundongos quanto em humanos em condições abaixo da termoneutralidade47, embora o aumento em humanos seja menor, o que é mais comum em camundongos. Isso é consistente com a perda de calor para o ambiente. Não medimos as concentrações plasmáticas de T3 no presente estudo, mas as concentrações podem ter sido menores no grupo de 30 °C, o que pode explicar o efeito desse grupo nos níveis plasmáticos de glucagon, visto que nós (Figura 5a atualizada) e outros demonstramos que o T3 aumenta o glucagon plasmático de forma dose-dependente. Há relatos de que os hormônios tireoidianos induzem a expressão de FGF21 no fígado. Assim como o glucagon, as concentrações plasmáticas de FGF21 também aumentaram com as concentrações plasmáticas de T3 (Figura Suplementar 5b e ref. 48), mas, em comparação com o glucagon, as concentrações plasmáticas de FGF21 em nosso estudo não foram afetadas pela temperatura. As razões subjacentes a essa discrepância requerem estudos adicionais, mas a indução de FGF21 mediada por T3 deve ocorrer em níveis mais altos de exposição a T3 em comparação com a resposta de glucagon mediada por T3 observada (Figura Suplementar 5b).
Foi demonstrado que a dieta rica em gordura (DRG) está fortemente associada à intolerância à glicose e à resistência à insulina (marcadores) em camundongos criados a 22 °C. No entanto, a DRG não foi associada à intolerância à glicose nem à resistência à insulina quando os camundongos foram criados em um ambiente termoneutro (definido aqui como 28 °C)19. Em nosso estudo, essa relação não foi replicada em camundongos obesos induzidos por dieta (OID), mas camundongos com peso normal mantidos a 30 °C apresentaram melhora significativa na tolerância à glicose. A razão para essa diferença requer estudos adicionais, mas pode ser influenciada pelo fato de que os camundongos OID em nosso estudo eram resistentes à insulina, com concentrações plasmáticas de peptídeo C em jejum e concentrações de insulina 12 a 20 vezes maiores do que as de camundongos com peso normal, e concentrações de glicose no sangue em jejum de cerca de 10 mM (cerca de 6 mM em peso corporal normal), o que parece deixar uma pequena janela para quaisquer efeitos benéficos potenciais da exposição a condições termoneutras na melhora da tolerância à glicose. Um possível fator de confusão é que, por razões práticas, o teste oral de tolerância à glicose (TOTG) é realizado à temperatura ambiente. Assim, os ratos mantidos em temperaturas mais elevadas sofreram um leve choque térmico, o que pode afetar a absorção/eliminação da glicose. No entanto, com base em concentrações semelhantes de glicose no sangue em jejum nos diferentes grupos de temperatura, as alterações na temperatura ambiente podem não ter afetado significativamente os resultados.
Como mencionado anteriormente, foi recentemente destacado que o aumento da temperatura ambiente pode atenuar algumas reações ao estresse por frio, o que pode colocar em questão a aplicabilidade de dados obtidos em camundongos a humanos. No entanto, não está claro qual é a temperatura ideal para a criação de camundongos que mimetize a fisiologia humana. A resposta a essa questão também pode ser influenciada pela área de estudo e pelo parâmetro analisado. Um exemplo disso é o efeito da dieta sobre o acúmulo de gordura no fígado, a tolerância à glicose e a resistência à insulina19. Em termos de gasto energético, alguns pesquisadores acreditam que a termoneutralidade é a temperatura ideal para a criação de camundongos, visto que os humanos necessitam de pouca energia extra para manter sua temperatura corporal central, e definem uma temperatura de colo única para camundongos adultos como 30 °C7,10. Outros pesquisadores acreditam que uma temperatura comparável à que os humanos normalmente experimentam com camundongos adultos em um dos joelhos é de 23-25 °C, já que encontraram a termoneutralidade entre 26-28 °C e, com base em dados humanos, uma temperatura cerca de 3 °C menor. Sua temperatura crítica inferior, definida aqui como 23 °C, é ligeiramente 8,12. Nosso estudo está de acordo com diversos outros estudos que afirmam que a neutralidade térmica não é alcançada entre 26 e 28 °C4, 7, 10, 11, 24, 25, indicando que 23-25 °C é uma temperatura muito baixa. Outro fator importante a ser considerado em relação à temperatura ambiente e à termoneutralidade em camundongos é o alojamento individual ou em grupo. Quando os camundongos foram alojados em grupos, em vez de individualmente, como em nosso estudo, a sensibilidade à temperatura foi reduzida, possivelmente devido à superlotação dos animais. No entanto, a temperatura ambiente ainda estava abaixo do limiar de tolerância à hipotermia (LTL) de 25 °C quando três grupos foram utilizados. Talvez a diferença interespecífica mais importante a esse respeito seja a importância quantitativa da atividade do tecido adiposo marrom (TAM) como defesa contra a hipotermia. Assim, enquanto os camundongos compensaram amplamente sua maior perda calórica aumentando a atividade do TAM, que representa mais de 60% do gasto energético (GE) a 5 °C,51,52 a contribuição da atividade do TAM humano para o GE foi significativamente maior, embora muito menor. Portanto, reduzir a atividade do TAM pode ser uma maneira importante de aumentar a transposição dos resultados para humanos. A regulação da atividade do tecido adiposo marrom (TAM) é complexa, mas frequentemente mediada pelos efeitos combinados da estimulação adrenérgica, hormônios da tireoide e expressão de UCP114,54,55,56,57. Nossos dados indicam que a temperatura precisa ser elevada acima de 27,5 °C em comparação com camundongos a 22 °C para detectar diferenças na expressão de genes do TAM responsáveis pela função/ativação. No entanto, as diferenças encontradas entre os grupos a 30 °C e 22 °C nem sempre indicaram um aumento na atividade do TAM no grupo de 22 °C, pois Ucp1, Adrb2 e Vegf-a apresentaram expressão reduzida nesse grupo. A causa raiz desses resultados inesperados ainda precisa ser determinada. Uma possibilidade é que o aumento na expressão desses genes não reflita um sinal de temperatura ambiente elevada, mas sim um efeito agudo da mudança de 30 °C para 22 °C no dia da remoção (os camundongos foram submetidos a essa mudança de 5 a 10 minutos antes da decolagem).
Uma limitação geral do nosso estudo é que analisamos apenas camundongos machos. Outras pesquisas sugerem que o sexo pode ser uma consideração importante em nossas principais indicações, visto que camundongos fêmeas com joelho único são mais sensíveis à temperatura devido à maior condutividade térmica e à manutenção de temperaturas corporais mais controladas. Além disso, camundongos fêmeas (em dieta rica em gordura) mostraram uma maior associação entre a ingestão de energia e o gasto energético a 30 °C em comparação com camundongos machos que consumiram mais energia do mesmo sexo (20 °C neste caso)20. Assim, em camundongos fêmeas, o efeito do conteúdo subtermodinâmico é maior, mas apresenta o mesmo padrão que em camundongos machos. Em nosso estudo, focamos em camundongos machos com joelho único, pois essas são as condições sob as quais a maioria dos estudos metabólicos que examinam o gasto energético são conduzidos. Outra limitação do nosso estudo foi que os camundongos receberam a mesma dieta durante todo o estudo, o que impediu a análise da importância da temperatura ambiente para a flexibilidade metabólica (medida pelas alterações na taxa metabólica basal em resposta a mudanças na composição de macronutrientes na dieta). em camundongos fêmeas e machos mantidos a 20 °C em comparação com camundongos correspondentes mantidos a 30 °C.
Em conclusão, nosso estudo demonstra que, assim como em outros estudos, camundongos com peso normal (lap 1) apresentam termoneutralidade acima da temperatura prevista de 27,5 °C. Além disso, nosso estudo mostra que a obesidade não é um fator isolante importante em camundongos com peso normal ou com obesidade induzida pela dieta (DIO), resultando em proporções temperatura:gasto energético (GE) semelhantes em camundongos DIO e com peso normal. Enquanto a ingestão alimentar de camundongos com peso normal foi consistente com o GE, mantendo assim um peso corporal estável em toda a faixa de temperatura, a ingestão alimentar de camundongos DIO foi a mesma em diferentes temperaturas, resultando em uma proporção maior de ganho de peso a 30 °C. A 22 °C, os camundongos ganharam mais peso corporal. De modo geral, estudos sistemáticos que examinem a importância potencial de viver abaixo de temperaturas termoneutras são necessários devido à baixa tolerância frequentemente observada entre estudos em camundongos e em humanos. Por exemplo, em estudos sobre obesidade, uma explicação parcial para a menor translatabilidade geral pode ser o fato de que estudos de perda de peso em camundongos geralmente são realizados em animais moderadamente submetidos a estresse por frio, mantidos em temperatura ambiente devido ao aumento do seu GE. Perda de peso exagerada em comparação com o peso corporal esperado de uma pessoa, em particular se o mecanismo de ação depender do aumento do gasto energético através do aumento da atividade da BAP, que é mais ativa e ativada à temperatura ambiente do que a 30°C.
Em conformidade com a Lei Dinamarquesa de Experimentação Animal (1987) e os Institutos Nacionais de Saúde (Publicação nº 85-23) e a Convenção Europeia para a Proteção de Vertebrados Utilizados para Fins Experimentais e Outros Fins Científicos (Conselho da Europa nº 123, Estrasburgo, 1985).
Camundongos machos C57BL/6J de 20 semanas de idade foram obtidos de Janvier Saint Berthevin Cedex, França, e receberam ração padrão (Altromin 1324) e água (~22°C) ad libitum, após um ciclo claro/escuro de 12:12 horas. Camundongos machos DIO (20 semanas) foram obtidos do mesmo fornecedor e receberam dieta rica em gordura (45% de gordura) (Cat. nº D12451, Research Diet Inc., NJ, EUA) e água ad libitum, em condições de criação. Os camundongos foram adaptados ao ambiente uma semana antes do início do estudo. Dois dias antes da transferência para o sistema de calorimetria indireta, os camundongos foram pesados, submetidos a ressonância magnética (EchoMRITM, TX, EUA) e divididos em quatro grupos correspondentes ao peso corporal, obesidade e peso corporal normal.
Um diagrama gráfico do desenho do estudo é mostrado na Figura 8. Os camundongos foram transferidos para um sistema fechado e com temperatura controlada de calorimetria indireta na Sable Systems International (Nevada, EUA), que incluía monitores de qualidade da água e dos alimentos e um sistema Promethion BZ1 que registrava os níveis de atividade medindo as interrupções do feixe de luz. Os camundongos (n = 8) foram alojados individualmente a 22, 25, 27,5 ou 30 °C, utilizando forração, mas sem abrigo ou material para ninho, em um ciclo claro/escuro de 12:12 horas (luz: 06:00–18:00). O fluxo sanguíneo foi de 2500 ml/min. Os camundongos foram aclimatados por 7 dias antes do registro. As gravações foram coletadas por quatro dias consecutivos. Posteriormente, os camundongos foram mantidos nas respectivas temperaturas de 25, 27,5 e 30 °C por mais 12 dias, após os quais os concentrados celulares foram adicionados conforme descrito abaixo. Entretanto, grupos de camundongos mantidos a 22°C permaneceram nessa temperatura por mais dois dias (para coletar novos dados basais). Em seguida, a temperatura foi aumentada em incrementos de 2°C a cada dois dias, no início da fase de luz (06:00), até atingir 30°C. Após isso, a temperatura foi reduzida para 22°C e os dados foram coletados por mais dois dias. Depois de mais dois dias de registro a 22°C, peles foram adicionadas a todas as gaiolas em todas as temperaturas, e a coleta de dados começou no segundo dia (dia 17) e continuou por três dias. Posteriormente (dia 20), material para ninho (8-10 g) foi adicionado a todas as gaiolas no início do ciclo de luz (06:00) e os dados foram coletados por mais três dias. Assim, ao final do estudo, os camundongos mantidos a 22°C permaneceram nessa temperatura por 21 dos 33 dias e a 22°C nos últimos 8 dias, enquanto os camundongos em outras temperaturas permaneceram nessa temperatura por 33 dias. Os ratos foram alimentados durante o período do estudo.
Camundongos com peso normal e camundongos obesos induzidos por dieta (DIO) seguiram os mesmos procedimentos do estudo. No dia -9, os camundongos foram pesados, submetidos a ressonância magnética e divididos em grupos comparáveis em peso corporal e composição corporal. No dia -7, os camundongos foram transferidos para um sistema fechado de calorimetria indireta com temperatura controlada, fabricado pela SABLE Systems International (Nevada, EUA). Os camundongos foram alojados individualmente com forração, mas sem materiais para ninho ou abrigo. A temperatura foi ajustada para 22, 25, 27,5 ou 30 °C. Após uma semana de aclimatação (dias -7 a 0, os animais não foram perturbados), os dados foram coletados em quatro dias consecutivos (dias 0 a 4, dados mostrados nas Figuras 1, 2 e 5). Posteriormente, os camundongos mantidos a 25, 27,5 e 30 °C permaneceram sob condições constantes até o 17º dia. Simultaneamente, a temperatura no grupo de 22 °C foi aumentada em intervalos de 2 °C a cada dois dias, ajustando-se o ciclo de temperatura (06:00 h) no início da exposição à luz (dados apresentados na Fig. 1). No 15º dia, a temperatura foi reduzida para 22 °C e dois dias de dados foram coletados para fornecer dados basais para os tratamentos subsequentes. Peles foram adicionadas a todos os camundongos no 17º dia e material para ninho foi adicionado no 20º dia (Fig. 5). No 23º dia, os camundongos foram pesados e submetidos a ressonância magnética, sendo então deixados em repouso por 24 horas. No 24º dia, os camundongos foram colocados em jejum desde o início do fotoperíodo (06:00) e receberam o teste oral de tolerância à glicose (OGTT) (2 g/kg) às 12:00 (6-7 horas de jejum). Posteriormente, os camundongos foram retornados às suas respectivas condições SABLE e eutanasiados no segundo dia (25º dia).
Camundongos DIO (n = 8) seguiram o mesmo protocolo que camundongos com peso normal (conforme descrito acima e na Figura 8). Os camundongos mantiveram uma dieta rica em gordura (HFD) de 45% durante todo o experimento de gasto energético.
O VO2 e o VCO2, assim como a pressão de vapor de água, foram registrados a uma frequência de 1 Hz com uma constante de tempo de célula de 2,5 min. A ingestão de alimentos e água foi coletada por meio do registro contínuo (1 Hz) do peso dos recipientes de comida e água. O monitor de qualidade utilizado apresentou uma resolução de 0,002 g. Os níveis de atividade foram registrados utilizando um monitor de matriz de feixes 3D XYZ; os dados foram coletados com uma resolução interna de 240 Hz e registrados a cada segundo para quantificar a distância total percorrida (m) com uma resolução espacial efetiva de 0,25 cm. Os dados foram processados com o Sable Systems Macro Interpreter v.2.41, calculando o gasto energético (GE) e a taxa de troca respiratória (RER) e filtrando valores discrepantes (por exemplo, eventos de refeição falsos). O Macro Interpreter está configurado para gerar dados para todos os parâmetros a cada cinco minutos.
Além de regular o gasto energético (GE), a temperatura ambiente também pode regular outros aspectos do metabolismo, incluindo o metabolismo da glicose pós-prandial, através da regulação da secreção de hormônios metabolizadores de glicose. Para testar essa hipótese, concluímos um estudo sobre a temperatura corporal, induzindo a obesidade induzida pela dieta (OID) em camundongos com peso normal por via oral (2 g/kg). Os métodos são descritos em detalhes no material suplementar.
Ao final do estudo (dia 25), os camundongos foram mantidos em jejum por 2 a 3 horas (a partir das 6h), anestesiados com isoflurano e submetidos à coleta completa de sangue por venopunção retro-orbital. A quantificação de lipídios plasmáticos, hormônios e lipídios no fígado é descrita nos Materiais Suplementares.
Para investigar se a temperatura da casca causa alterações intrínsecas no tecido adiposo que afetam a lipólise, o tecido adiposo inguinal e epididimal foi excisado diretamente de camundongos após a última etapa de sangramento. Os tecidos foram processados utilizando o ensaio de lipólise ex vivo recém-desenvolvido, descrito nos Métodos Suplementares.
O tecido adiposo marrom (TAM) foi coletado no dia do término do estudo e processado conforme descrito nos métodos suplementares.
Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). Os gráficos foram criados no GraphPad Prism 9 (La Jolla, CA) e editados no Adobe Illustrator (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA). A significância estatística foi avaliada no GraphPad Prism e testada por teste t pareado, ANOVA de medidas repetidas de uma ou duas vias seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey, ou ANOVA de uma via não pareada seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey, conforme necessário. A distribuição gaussiana dos dados foi validada pelo teste de normalidade de D'Agostino-Pearson antes da realização dos testes. O tamanho da amostra é indicado na seção correspondente da seção "Resultados", bem como na legenda. Repetição é definida como qualquer medição realizada no mesmo animal (in vivo ou em uma amostra de tecido). Em termos de reprodutibilidade dos dados, uma associação entre o gasto energético e a temperatura corporal foi demonstrada em quatro estudos independentes utilizando diferentes camundongos com um delineamento experimental semelhante.
Protocolos experimentais detalhados, materiais e dados brutos estão disponíveis mediante solicitação razoável ao autor principal, Rune E. Kuhre. Este estudo não gerou novos reagentes exclusivos, linhagens celulares/animais transgênicas ou dados de sequenciamento.
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o resumo do relatório de pesquisa da Nature vinculado a este artigo.
Todos os dados formam um gráfico. Os dados 1 a 7 foram depositados no repositório da base de dados Science, número de acesso: 1253.11.sciencedb.02284 ou https://doi.org/10.57760/sciencedb.02284. Os dados apresentados no Material Suplementar Eletrônico podem ser enviados a Rune E. Kuhre após testes adequados.
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Data da publicação: 28/10/2022
